Ⅱ型胶原特异性T细胞系与关节炎发病机制的研究

奚正德 上海第二医科大学 　　张冬青 上海市免疫学研究所

　　【摘要】 目的 建立Ⅱ型胶原特异性T细胞系，研究其对关节炎的诱导作用。方法 通过用弗氏完全佐剂乳化的鸡Ⅱ型胶原（CCⅡ）皮内免疫注射诱导Wistar大鼠胶原诱导性关节炎(CIA)。取CIA大鼠肠系膜淋巴细胞在体外用CCⅡ刺激扩增、建立CCⅡ反应性T细胞系。用3H-TdR掺入试验和流式细胞术分别测定其克隆扩增情况和表型格局。观察T细胞系过继转输后Wistar大鼠关节炎的发生情况, 同时通过肉眼观察和组织化学法鉴定受体大鼠踝关节的病理特征；并用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中抗CCⅡ抗体。结果 成功建立T细胞系。通过用荧光素标记抗体作细胞表型分析显示：所建细胞系98.2％为T细胞，其中89.7%为CD4＋T细胞。过继转输试验结果显示：当注入细胞为5×107时可导致50％大鼠产生关节炎，抗CCⅡ抗体也较对照组明显升高。结论 成功建立T细胞系；T细胞系转移关节炎的结果提示：T细胞在CIA发病机制中具有重要作用。这为RA发病机制的研究和T细胞疫苗的治疗提供了实验依据。

　　【关键词】关节炎，实验性；胶原诱导性关节炎；过继转移；T淋巴细胞； 抗CCⅡ抗体；胶原Ⅱ型

　　胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）是通过用Ⅱ型胶原（type Ⅱ collagen，CⅡ）免疫鼠类诱导的多关节炎症。由于其引起的症状和关节病理与类风湿性关节炎（rheumatoid artgritis, RA）相似(滑膜增生、细胞浸润、软骨侵蚀、骨吸收和重塑)，CIA 被认为是人类RA的独特动物模型，被较广泛地用于RA机制的研究[1,2]。已有实验显示：对CⅡ的免疫应答与CIA的发病机制相关，自身反应性T细胞介导了CIA的发病，但其致病机制尚不清楚。用T细胞可以转移疾病和免疫组织化学发现关节炎中可检测到活化的T细胞，提示自身反应性T细胞对疾病的发生是必需的。对实验性自身免疫性动物模型（诸如实验性变态反应性脑脊髓膜炎, EAE）T细胞方面的研究通常涉及建立自身反应性T细胞系，并用于进行疾病的过继转移 [2]。为了阐明T细胞在CIA中的作用，我们应用同样的方法建立了胶原诱导性关节炎CⅡ反应性T细胞系，并鉴定其细胞表型，观察其将关节炎转移给正常大鼠的能力。

1 材料和方法
1.1 大鼠和试剂：雌性近交系Wistar大鼠(4-6周龄，体重180±10克)购自中国科学院上海实验动物中心, 于上海第二医科大学实验动物中心清洁级饲养。鸡Ⅱ型胶原（chicken type Ⅱ collagen, CCⅡ）购自Sigma公司。重组人IL-2购自GIBCO BRL(invitrogen)。3H-TdR购自中国科学院原子核研究所。

1.2 免疫注射：CIA的诱导参照文献[2]。简言之，用前16－24小时CCⅡ以5 mg/ml的浓度溶于0.01M醋酸，4℃保存过夜。用完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant, CFA）等体积混匀、乳化（BCG的终浓度为2mg/ml）。每只大鼠以0.2 ml（含500μg CCⅡ）的剂量尾根部和背部皮下多点注射，CFA用等体积醋酸溶液稀释后作对照。

1.3 关节炎的分级评估：每周3次评估大鼠远端关节肿胀和红斑的出现情况。根据Wood法对关节炎的严重程度进行分级评估[3]。四肢末端至肘部或膝部的病损每足被主观分成0－4级（根据涉及的关节数目、红斑和水肿的程度：0－正常；1－红肿；2－肿胀；3－足趾畸形；4－踝部畸形，不能负重）。关节炎指数（arthritis index, AI）=四肢关节评分之和；平均关节炎指数（mean arthritis index, MAI）=总关节炎指数/每组大鼠的总数。这一方法同时用于CIA和过继性关节炎的评价。

1.4 CCⅡ特异性T淋巴细胞系的建立采用半有限稀释法[4] 。在大鼠免疫后的第14天选择有关节炎初期表现的大鼠,无菌条件下取其肠系膜淋巴结,置于无菌尼龙网中研磨成单细胞悬液,用无血清的RPMI1640洗涤2次后，以比重为1.088的大鼠淋巴细胞分离液分离去少量的红细胞。再用含5%自身血清(56℃水浴灭活30min)的RPMI1640培养液调节细胞浓度至5×106/ml，在96孔U型培养板中每孔加入100μl细胞悬液及终浓度为40μg/ml的CCII，37℃、5%CO2培养3d，弃培养上清，同时加入含IL-2(20U/ml)及5%自身血清的RPMI1640培养液100 μl，以后每隔3d换液一次，直至 2周。完全弃营养液，加入不含IL-2的RPMI1640 150μl/孔，将细胞悬液均分至3孔中，同时在各孔中加入2×106经30Gy 60Co辐射后的同系正常大鼠的脾脏细胞作为抗原递呈细胞（antigen-presenting cell, APC）。在这三孔中，一孔不加CCII抗原作为对照，另外两孔加入CCII抗原，分别作为实验组和备份组，各孔终体积为200μl，置于37℃、5% CO2培养72h，培养终止前12h加 入1.85×104Bq [3H]-TdR。收集实验组和对照组的细胞，用β液闪仪测定每分钟计数值，并计算刺激指数SI(实验组/对照组)。挑选SI>3的备份组的细胞于新板中，用含IL-2的RPMI1640液进行扩增，每隔3d半量换液至2周。然后完全弃营养液，各孔用不含IL-2的RPM11640悬浮细胞，并均分3份。重复上述操作。经过3个循环的刺激，建立CCII特异的T淋巴细胞系。

1.5 增生试验：建系细胞于微孔培养板板中三复孔培养，每孔含有5×105建系细胞和1×106辅佐细胞（经30Gy照射），加最适浓度的CCII抗原。培养72h后，在最后12h每孔脉冲加入1.85×104Bq [3H]-胸腺嘧啶。收获细胞，在液闪仪中测胸腺嘧啶的掺入量，结果用cpm均值表示。

1.6 T细胞系表型分析：建系细胞（106细胞/样品）用1%BSA 0.1%NaN3 PBS洗涤3次。加10μl FITC-抗大鼠CD3，10μl PE-抗大鼠CD4，5μl Cy5-抗大鼠CD8，4℃孵育30min。用1%BSA 0.1%NaN3 PBS洗涤3次，细胞重悬于含1%甲醛的PBS（pH7.2）中。用FACScan(BD)分析T细胞系表型。

1.7 T细胞系的过继转输及关节炎的观察和鉴定：经体外抗原刺激、扩增获取的T细胞系，以PBS液洗涤3次。分别调至各种浓度，从尾静脉缓缓注入正常受体大鼠。每天检查关节炎发生情况；于转移后第15天，断颈处死大鼠，取病足浸泡于10%甲醛中，脱钙处理后石蜡包埋、切片，作苏木精-伊红（H-E）染色，光镜观察滑膜、软骨和骨的变化。

1.8 血清抗CCⅡ抗体水平的检测：取注射建系细胞不同天数的受体大鼠和正常对照血清，-20℃保存，热灭活后作酶联免疫吸附试验(ELISA)。简言之，96孔平底微量板（Costar）用100μl/孔（25μg/ml）37℃包被1h，用含有1%BSA的PBS200μl封闭1h。洗涤3次，平板用100μl 1:500稀释的混合大鼠血清37℃孵育1h。平板洗涤3次后每孔加100μl 1：2500稀释HRP-标记的羊抗大鼠IgG抗体，37℃孵育1h。洗涤后每孔加100μl的过氧化物酶底物邻苯二胺（OPD），室温避光孵育30min。在酶标仪（Bio-Rad 550）上490nm测A值。

1.9 统计学分析：数据用x±S表示，差异显著性用单向方差分析加Duncan检验。

2 结果
2.1 CIA的诱导率和严重度：免疫后第12-45天，用 CCⅡ+CFA乳剂免疫的实验组60只大鼠中有54个大鼠发生关节炎，发病率为90%；而40只对照鼠无一发病。发病大鼠最易受累的是踝关节和足趾关节，且后肢首先发病；在免疫后第27天时，发病大鼠的关节炎指数最高，平均关节炎指数（MAI）为8.1。

2.2 T细胞系对CCⅡ的增生反应：用各种浓度的CCⅡ刺激使细胞（5×105/孔）增殖,最大的增生出现在CCⅡ浓度为40μg/ml时，达到最大反应需培养3d。因此，整个实验过程取5×105细胞/孔，与40μg/ml CCⅡ培养3d。

2.3 T细胞系的建立和分析：检测T细胞系的长期抗原特异性，见表1。在体外用CCⅡ抗原和IL-2刺激2次后对CCⅡ的反应的建系细胞明显增加，而对纯蛋白衍生物（PPD）的反应下降。3次刺激后，建系细胞显示CCⅡ特异性增生反应，达到阳性对照（用丝裂原Con A）水平，而与PPD培养增生反应呈阴性。

表1 CCⅡ特异性T细胞增生反应（x±s）
刺激循环数 每孔细胞数（104） 增殖反应（cpm）
培养基 CCⅡ PPD Con A
0 50 3584±422 6466±629 11477±1031 18866±2126
1 50 1998±216 8684±981▲ 6445±829 16556±1763
2 50 1240 ±157 9986±965▲ 1876±194 13364±1512
3 50 887 ±93 11145±1057▲ 762±96 11676±1275
注：▲与前一轮刺激比较P<0.05

2.4 细胞系的表型：用荧光素标记抗体作流式细胞分析结果显示：经3次刺激后，建系细胞98.2％为T细胞，其中89.7%是CD4＋T细胞。

2.5 用细胞系过继转输诱导关节炎：上述T细胞系以每只105－107细胞静脉注入正常Wistar受体大鼠，见表2。60只接种的大鼠中有9只出现关节炎。图1为接受CCⅡ特异性T细胞（5×107）的雌性大鼠发生过继性关节炎（15d，关节炎评分为3），右侧为正常对照。关节炎的发病约在T细胞系注入后7－9d出现，症状表现持续约15d，然后逐渐消退。组织学可见炎性细胞浸润、滑膜增生，并有软骨和骨侵蚀（见图3），右侧为正常对照。

图1 接受CCⅡ特异性T细胞大鼠发生过继性关节炎的关节，右侧为正常对照大鼠的关节。

图2过继性关节炎大鼠踝关节的组织学表现（15d），可见滑膜增生、单核细胞浸润、软骨和骨破坏，右侧为正常对照大鼠的组织学表现。苏木精和伊红染色（×100）。SM：滑膜；Ca：软骨；Bn：骨；AC：关节腔。

　　表2 CCⅡ特异性细胞系转移关节炎的结果

　　注：与正常对照相比▲P<0.05，△P<0.01　

2.6 抗CCⅡ抗体水平：见表2，当建系细胞数为1×106时，大鼠抗CCⅡ抗体水平（15d）比对照轻微升高（P<0.05），但没有关节炎症状出现；当建系细胞数超过5×106时，抗CCⅡ抗体水平明显高于对照大鼠（P<0.01），并可见受体大鼠出现关节炎症状。

3 讨论
CⅡ是一种组织局限性蛋白，主要存在于关节软骨和眼球组织中；它是活动关节（CIA炎症的主要发生部位）关节软骨的主要组成蛋白，关节损伤导致CⅡ的释放并刺激免疫系统产生自身免疫攻击被认为是RA发生的机制之一。CⅡ因其可能是RA的潜在抗原而受到关注，在RA病人中可检测到对CⅡ的免疫反应。用鸡Ⅱ型胶原（CCⅡ）免疫大鼠可以诱导出一种对CCⅡ产生自身免疫应答的侵蚀性多关节炎，称为胶原诱导性关节炎。CIA的表现在许多方面与人类的RA相似，它们特征都是滑膜炎伴有软骨和软骨下关节翳的形成、浸润。因此，CIA已成为研究RA致病机制的独特动物模型[1]。
大量的研究证据提示CIA和RA都是Th1介导的自身免疫应答所致疾病。RA病人的滑膜组织表达IFN-γ，但没有IL-4转录； IFN-γ表达的增高与疾病的严重性相关。最近的研究发现CIA是Th1介导的，对CⅡ特异性的Th1免疫应答是CIA的诱导和致病必需的[5]。
自身反应性T细胞参与了几种实验性疾病模型的发病。研究最多的是实验性变态反应性脑脊髓膜炎模型（EAE）。已有研究从用髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫的小鼠和大鼠中分离得到了自身反应性T细胞，这些T细胞可以经过继转输诱导受体鼠产生疾病[6]。在实验性自身免疫性甲状腺炎中也得到了相似的结果[7]。在本研究中，我们通过皮下免疫注射CCⅡ诱导CIA，然后分离了单个核细胞，在抗原递呈细胞存在的情况下，加CCⅡ和IL-2刺激、扩增3个循环建立了CCⅡ反应性T细胞系。用流式细胞仪作表型分析，结果显示建系细胞98.2％是T细胞，其中89.7%是CD4+T细胞。通过尾静脉注射建系细胞可以诱导正常大鼠发生关节炎，并经病理切片证实。当注入细胞为5×107时关节炎的发生率为50％，发病受体大鼠的踝关节和趾关节的组织化学检查有典型的关节炎病理特征。当注入细胞为1×106时，大鼠没有发生明显的关节炎，但抗CCⅡ抗体水平升高。
总之，我们的研究结果提示：CⅡ诱导性关节炎可以通过CⅡ特异性T细胞系过继转移给正常受体鼠，且支持CIA是由T淋巴细胞免疫应答介导的假说；对CⅡ特异的免疫应答可能是CIA中的主要关节致病原因。我们的研究结果为T细胞疫苗治疗RA提供了有力的研究证据。

参考文献

1. 奚正德，张冬青，张雁云，等。小鼠胶原诱导性关节炎的研究进展。自然杂志 2003；25(1): 36-41
2. Malfait AM, Williams RO, Malik AS, et al. Chronic relapsing homologous collagen-induced arthritis in DBA/1 mice as a model for testing disease-modifying and remission-inducing therapies. Arthritis Rheum. 2001;44(5):1215-24.
3. Larsson P, Kleinau S, Holmdahl R, et al. Homologous type II collagen-induced arthritis in rats. Characterization of the disease and demonstration of clinically distinct forms of arthritis in two strains of rats after immunization with the same collagen preparation. Arthritis Rheum. 1990;33(5):693-701.
4. Zhang J, Markovic-Plese S, Lacet B, et al. Increased frequency of interleukin 2-responsive T cells specific for myelin basic protein and proteolipid protein in peripheral blood and cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis. J Exp Med 1994 Mar 1;179(3):973-84
5. Simon AK, Seipelt E, Sieper J. Divergent T-cell cytokine patterns in inflammatory arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A 1994 ;91(18):8562-6.
6. Beraud E, Balzano C, Zamora AJ, et al. Pathogenic and non-pathogenic T lymphocytes specific for the encephalitogenic epitope of myelin basic protein: functional characteristics and vaccination properties. J Neuroimmunol 1993;47(1):41-53.
7. Peterson KE, Braley-Mullen H. Suppression of murine experimental autoimmune thyroiditis by oral administration of porcine thyroglobulin. Cell Immunol 1995;166(1):123-30.

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